棠汰汰—刘东波教授论文（稳定表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛 β 细胞株的构建）(2)

　　G418 试剂(Sigma 公司, 美国); 防荧光淬灭封片剂(SouthernBiotech 公司, 美国); SQSTM1/P62 (seques-tosome 1)抗体、S6K (ribosomal protein S6 kinase)抗体、phospho-S6K 抗体(CST 公司, 美国); GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)抗体[亚太恒信生物科技(北京)有限公司]; 6× loading

　　buffer (北京全式金生物技术有限公司)。激光共聚焦显微镜(Zeiss LSM710); 倒置荧光显微镜(LeicaDMI8)。

　　1.2慢病毒载体构建

　　慢病毒载体构建由上海吉凯基因科技有限公司完成, 构建过程主要参照文献[12]的方法, 简要概述如下: 用 PCR 从 PCMV-RFP-GFP-LC3 质粒中扩增 RFP-GFP-LC3 片段; 扩增产物 10 g/L 琼脂转化, 筛选出重组质粒, 得到 RFP-GFP-LC3-GV374 质粒。经过测序比对确认慢病毒载体构建成功(图1), 提取重组质粒, 纯化溶解, -20 ℃保存。

　　1.3慢病毒的包装制备

　　用含有 10% FBS 的 DMEM 基础培养基于37 ℃、5% CO 2 培养箱中培养 293FT 细胞, 细胞状态良好。待细胞汇合至 90%左右, 将其用含0.25%of autophagy related to diabetic medicines.Key words: diabetes; autophagy; lentivirus transfection; RIN-m5f cells(Life Science Research，2019，23(2)：087～091)88第 2 期 周佳丽等：稳定表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛 β 细胞株的构建。

　　图 1 LC3 自噬流检测慢病毒载体图谱

　　Fig.1 The vector of lentivirus for detecting LC3

　　EDTA 的胰酶消化, 种入 6 孔板中, 培养 24 h。待细胞汇合度达 50%左右时, 进行换液处理并按照转染试剂 Lipofectamine TM 3000 的说明书进行操作。即将 VSVG 质粒、Δ8.9 质粒、RFP-GFP-LC3质粒进行质量浓度 1︰1︰1 的共转染, 转染完成后将细胞置于 37 ℃、5% CO 2 培养箱中继续培养24 h。到达时间后, 于倒置荧光显微镜下观察转染效率, 并收集细胞上清液, 3 000 r/min 离心 10 min,去除残余的 293FT 细胞杂质, 即得到已包装好RFP-GFP-LC3 质粒的慢病毒颗粒。

　　1.4稳定细胞株的筛选

　　转染前一天, 将 RIN-m5f 用 0.25% EDTA 胰酶进行消化, 种入 6 孔板中。用含 10% FBS 的1640 培养基培养 24 h 后, 将收集的慢病毒颗粒加入细胞培养液中, 对细胞进行换液处理。24 h后, 在倒置荧光显微镜下观察转染情况, 并更换新的培养基。感染约 48 h 后, 加入嘌呤霉素进行筛选培养。预实验提示 RIN-m5f 细胞的嘌呤霉素最佳筛选质量浓度为 6 μg/mL。筛选培养约 7 d后, 未经感染的对照组细胞全部死亡, 感染组有阳性克隆细胞生长, 荧光显微镜下可见 RFP 荧光

　　与 GFP 荧光。用 0.25% EDTA 胰蛋白酶消化阳性克隆细胞, 转移到新的培养皿中继续培养 2 d, 随后收集感染病毒的稳定细胞株, 用细胞免疫荧光的方法检测 RFP-GFP-LC3 的表达。

　　1.5自噬的诱导及自噬流的检测

　　构建成功的细胞以 1×10 5 的数目种入 24 孔板中, 37 ℃、5% CO 2 条件下培养过夜。待细胞汇合至 70%左右, 对照组使用含 10% FBS 的 1640培养基继续培养, 饥饿组加入无血清 1640 培养基饥饿 2 h, 在饥饿+氯喹(chloroquine, CQ)组, 使用 10 μmol/L 的氯喹与饥饿共处理 2 h。到达预定处理时间后, 用 PBS 清洗两遍, 将玻片夹出反向固定于载玻片上, 于激光共聚焦下拍摄 RFP-GFP-LC3 荧光点。

　　1.6 Western-blot分析

　　构建成功的细胞以 1×10 5 的数目种入 24 孔板中, 37 ℃、5% CO 2 条件下培养过夜。待细胞汇合至 95%左右, 加入无血清 1640 培养基饥饿处理 2 h, 在饥饿+CQ 组, 使用 10 μmol/L 的氯喹与饥饿共处理 2 h。到达预定时间后, 用 PBS 洗涤细胞, 每孔加入 200 μL 2% SDS 细胞裂解液, 迅速将细胞刮下收集。每管加入 40 μL 的 6× loadingbuffer, 煮至蛋白质变性, 蛋白质可置于-20 ℃冰箱保存备用。12% SDS-PAGE 电泳后, 电转移至PVDF 膜上, 封闭液室温封闭 1 h, 按照 1︰1 000的稀释比例, 分别孵育 P62、S6K、P-S6K、GAPDH一抗, 4 ℃过夜, 加入对应二抗稀释液(1︰5 000),室温孵育 1 h, ECL 发光显影。

　　1.7统计学处理

　　所有数据用平均值±标准差(x±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析; 显著性水平为 P<0.05。

　　2结果

　　2.1稳定细胞系的筛选

　　慢病毒转染 48 h 后, 用嘌呤霉素对已转染细胞株进行筛选。大约 7 d 后, 经过筛选的细胞如图2所示, 在荧光显微镜下观察到 100% 表达红色/绿色荧光, 表明稳定表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛细胞已经建立成功。

　　2.2自噬的诱导以及自噬流的检测

　　如图 3A 所示, 在本实验中可明显观察到对照组中自噬体较少且红色荧光与绿色荧光的表达量一致。经过饥饿自噬诱导以后, 自噬点显著增加, 细胞中绿色荧光点的表达量显著低于红色荧光的表达量。该现象是由于饥饿诱导形成了自噬流, 自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体, 在自噬溶酶体的酸性环境下, 绿色荧光点发生淬灭。在对细胞进行饥饿处理的同时加入 10 μmol/L 的CQ, 发现绿色荧光的表达量较饥饿组略有回升。这是因为自噬阻断剂 CQ 部分阻断了自噬体与溶酶体的结合, 从而导致绿色荧光表达量的上升。单个细胞中红绿荧光点的比值在各组间具有统计学差异(图 3B)。