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棠汰汰—刘东波教授论文(稳定表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛 β 细胞株的构建)

2019-09-23 17:08    来源:东方经济网      字号:

  9月6日,首个国家亚健康干预技术成果应用中心落户长沙麓谷,国家中医药管理局亚健康干预技术实验室隶属于国家中医药管理局,是国内唯一从事亚健康干预技术研究的专业机构,拥有以国家973项目主持人、教育部新世纪优秀人才为核心的研究团队,专业从事亚健康干预技术的研究。2012年9月,该实验室主任刘东波教授当选为联合国亚太亚健康干预技术联盟主席,以“未病防病、既病防变、愈后防复”为目标,对慢性非传染性疾病提出心理、行为、膳食和营养干预方案,并于2016年成立了国家中医药管理局亚健康干预技术实验室糖尿病干预中心。糖尿病作为实验室创立后的一个重要的慢性病研究对象,历经长期研究,独创了国内第一套糖尿病中医营养干预技术。

  刘东波教授文献当中分享了国家中医药管理局亚健康干预技术实验室糖尿病干预中心研究成果。他指出,糖尿病中医营养干预技术就是以三低三高(低血糖负荷、低卡路里、低碳水化合物和高不饱和脂肪酸、高膳食纤维、高药食同源)的饮食模式和间歇性禁食方式治疗糖尿病,以科学的方法为导向,重点教会糖尿病病人正确的健康生活方式,教会他们自我管理血糖的方法,逐步实现恢复胰岛功能,重新夺回控制血糖的主动权,帮助广大糖尿病患者控制病情发展的问题,有利于糖尿病患者科学的自我管理,达到改善健康状况或治疗疾病的目标。

  以下是刘东波教授的文献:

  稳定表达 RFP-GFP-LC3 的大鼠胰岛 β 细胞株的构建

  周佳丽 1, 3 , 吴艳阳 2 , 罗玉霜 1, 3 , 袁玉菊 2 , 刘明俊 6 , 刘东波 1, 3, 4, 5*

  1. 湖南农业大学 园艺园林学院, 中国湖南 长沙 410128;

  2. 湖南农业大学 食品科学技术学院, 中国湖南 长沙 410128;

  3. 国家中医药管理局亚健康干预技术实验室, 中国湖南 长沙 410128; 4. 湖南省作物种质创新与资源利用重点实验室,

  中国湖南 长沙 410128; 5. 湖南省植物功能成分利用协同创新中心, 中国湖南 长沙 410128; 6. 湖南省马王堆医院,中国湖南 长沙 410128

  摘 要 : 为了简便自噬相关机理药物在胰岛 β 细胞上的高通量筛选 , 实验通过慢病毒转染技术 , 将 RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛 β 细胞株 (RIN-m5f), 用 G418 对感染细胞进行筛选 , 激光共聚焦进行活细胞拍摄验证 , 得到100% 表达 RFP-GFP-LC3 质粒的细胞株。 无血清饥饿处理细胞 , 结果显示 : 饥饿组GFP/RFP 荧光点比值较对照组下降 , P62 蛋白表达量以及 S6K 磷酸化水平降低 , 加入 10 μmol/L 氯喹部分抑制自噬后 , GFP/RFP 荧光点比值回升。 以上结果表明稳定表达 RFP-GFP-LC3 的 RIN-m5f 构建成功 , 并能够以简单的检测方式准确表达自噬全过程 , 为自噬在糖尿病药物机理方面的研究奠定了基础。

  关键词 : 糖尿病 ; 自噬 ; 慢病毒转染 ; RIN-m5f 细胞株

  中图分类号 : Q291 文献标识码: A 文章编号 : 1007-7847(2019)02-0087-05

  糖尿病是一种全球性的、以持续高血糖症为特征的代谢紊乱疾病。血糖异常升高的原因可能是胰岛素自身分泌缺陷(1 型糖尿病, T1D), 或肝脏等效应器官产生胰岛素抵抗, 或胰岛素分泌不足(2 型糖尿病, T2D)

  [1] 。在 T1D 和 T2D 的情况下, 持续高浓度的葡萄糖会引起细胞内抗氧化能力的失衡, 导致亚硝基介导的氧化应激和损伤。氧化和糖化蛋白的积累是糖尿病相关的常见蛋白质修饰, 其部分原因可能是自噬缺陷

  [2] 。因此, 越来越多的研究认为相关细胞自噬可能有利于糖尿病的治疗。β 细胞是人体内唯一能够分泌胰岛素的功能细胞, 研究 β 细胞的自噬对于糖尿病的治疗与控制具有重大意义。相关研究报道, β 细胞自噬可通过调控胰岛素颗粒的降解来影响细胞胰岛素的释放 [3~4] 。自噬是真核细胞内一种高度保守的再循环过程, 它通过降解细胞质中的细胞器、蛋白质和大分子物质, 对分解产物进行再利用。自噬在细胞存活和功能维持中起着重要作用 [5] 。细胞自噬由多个步骤组成, 其中包括:

  1) 吞噬泡的形成;

  2) 自噬体的形成;

  3) 自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体;

  4) 自噬溶酶体的降解 [6] 。自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程, 自噬流的活化或受阻往往会形成不同的生物学效应 [7] 。人们在研究过程中逐渐发现, 自噬流受阻可能诱发多种疾病 [7] 。微管相关蛋白轻链 3 (microtubule-associatedprotein light chain 3, LC3)是自噬体膜标志物, 一般散在分布于细胞质 [8] 。在自噬过程中, 胞质形式的LC3 (LC3-Ⅰ)与磷脂酰乙醇胺结合形成 LC3-磷脂酰乙醇胺结合物(LC3-Ⅱ) [9] 。

  红色荧光点-绿色荧光点-LC3 (red fluorescence point-green fluores-cence point-LC3, RFP-GFP-LC3)融合蛋白是一种方便的自噬荧光蛋白标记物。在自噬发生初期,

  胞浆型 LC3 转变为膜型 LC3, 在荧光显微镜下可观察到红色/绿色共定位的点状聚集。自噬后期,溶酶体与自噬体融合形成自噬溶酶体, 细胞环境pH 发生变化。当环境 pH<5 时, GFP 荧光敏感发生淬灭, 只能检测到红色荧光点状聚集 [10] 。因此可以通过 GFP 荧光点与 RFP 荧光点比例来评价自噬流进程。目前可通过瞬时转染的方法检测自噬流, 通过在细胞中瞬时高表达 RFP-GFP-LC3 质粒来进

  行后续实验 [11] , 但是瞬时转染的方法具有稳定性差、转染效率低等缺点。为解决这一问题, 我们通过慢病毒转染的方法构建了能够稳定表达 RFP-GFP-LC3 质粒的大鼠胰岛 β 细胞株, 这将有利于研究自噬在胰岛 β 细胞中的作用, 同时也可将其用于治疗糖尿病药物的初步筛选。

  1材料与方法

  1.1材料

  慢病毒包装系统(该病毒系统包括 VSVG 质粒、Δ8.9 质粒); 293FT 细胞、RIN-m5f 细胞株(湖南农业大学亚健康实验室冻存); DH5α 感受态细胞(北京全式金生物技术有限公司)。DMEM 培养基、1640 培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(Biological Industries 公司, 以色列); Trypsin-ED-TA 细胞消化液(北京全式金生物技术有限公司);Lipofectamine TM 3000 转染试剂(Thermo 公司, 美国);

作者:佚名   责任编辑:刘洋
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